A SZÖVETI ŐSSEJTEK PROGRAMOZOTT ÁTALAKULÁSAI –

LEHETSÉGES-E A TRANSZDIFFERENCIÁCIÓ?

Uher Ferenc

PhD, Dr. habil., Országos Vérellátó Szolgálat Őssejt-biológia

Az egyedfejlődés alapja, hogy miközben a totipotens zigótából kialakul a soksejtű élőlény, az egyes sejtek egyre specializáltabbakká válnak, szövetekbe, szervekbe rendeződnek és kialakítják az egyed végső formáját. Történik ez annak ellenére, hogy az összes sejt ugyanazon genetikai információt, ugyanazt a génkészletet hordozza.

A különböző sejtfejlődési sorok irányába történő elköteleződés, az eltérő speciális funkciók ellátására alkalmas testi sejtek kialakulása az ontogenezis során lezajló epigenetikai (a DNS-molekula nukleotidszekvenciáját nem érintő) változások sorozatának következménye. Minden differenciálódó sejtben más-más „epigenetikai mintázat” alakul ki, ami biztosítja, hogy az adott sejtben csak az arra a sejttípusra jellemző funkció(ka)t ellátó gének fejeződjenek ki. A folyamatot legjobban a Waddington-féle „epigenetikus tájkép” (Waddington, 1957) hasonlat segítségével szemléltethetjük (1A ábra). Ha egy hegycsúcsról legurítunk egy pluripotens sejtet szimbolizáló golyót, az számos kisebb-nagyobb völgy felé gurulhat, míg az egyik völgy legmélyebb pontján megállapodik. Ez az állapot felel meg valamely véglegesen differenciálódott, stabil fenotípusú testi sejtnek. Útjuk során a golyók természetesen átmennek egy köztes, a szöveti őssejteknek megfelelő multipotens fejlődési fázison is, amikor a testi sejtekhez képest még sok, de a pluripotens sejtekkel összehasonlítva már viszonylag kevés különböző gént fejeznek ki. Egy szöveti őssejt tehát potenciálisan többféle genetikai program megvalósítására képes. A döntés, hogy e lehetőségek közül adott esetben melyik realizálódik – azaz milyen irányba kezd differenciálódni a sejt – részben valószínűségi alapon, részben környezeti tényezők hatására történik (Halley et al., 2008). A különböző típusú, a völgyek mélyén megállapodott testi sejteket viszont hegyek vagy legalábbis dombok választják el egymástól, csak ezeken „átkapaszkodva” juthatnak át egy másik völgybe, azaz alakulhatnak át más fenotípusú és funkciójú testi sejtté (1B ábra). Ezt a folyamatot, amikor egy véglegesen differenciálódott „A” sejtből egy eltérő fenotípusú, „B” típusú testi sejt jön létre, anélkül, hogy közben bármilyen átmeneti sejtalak megfigyelhető lenne, transzdifferenciációnak nevezzük. Az őssejtbiológiában – tágabb értelemben – akkor is transzdifferenciációról beszélünk, ha egy adott sejtfejlődési sorba tartozó szöveti (például: vérképző) őssejtből egy másik sejtfejlődési sorra (például: izom- vagy idegszövet) jellemző multipotens sejttípus alakul ki. A transzdifferenciálódás tehát valójában a sejtek genetikai újraprogramozását jelenti, amikor az „A” sejtre jellemző gének inaktiválódnak, miközben a gének egy másik, a „B” sejtekre jellemző csoportja aktiválódik anélkül, hogy a sejt közben átmenne egy köztes, pluripotens (vagy legalábbis dedifferenciálódott) állapoton. Mivel a véglegesen differenciálódott sejtek fenotípusának stabilitása fontos, ezért transzdifferenciáció valószínűleg csak az egyedfejlődés és/vagy szövetregeneráció során történik (Takahashi, 2012).

Transzdifferenciáció in vivo

Bár a spontán transzdifferenciáció alapvetően ritka jelenség az emlősök körében, azért mind az egyedfejlődés, mind a regeneráció során találunk rá példákat. Az egyik legismertebb ilyen genetikai átprogramozás az egér nyelőcsövében figyelhető meg. A magzat nyelőcsövének falában kizárólag simaizomsejtek találhatók, a posztnatális időszakban azonban ezek egy része mioblaszttá, majd a mioblasztok fúziója révén harántcsíkolt izomrostokká alakul (Patapoutian et al., 1995). A tüdőben – amelynek epitéliuma folyamatosan károsodásnak van kitéve – a regeneráció során a csillós sejtekből transzdifferenciálódik a többi, megújuló epitél sejt (Park et al., 2006). Más gerincesekben, mint a szalamandra, gőte, béka, sőt a csirke, az eltávolított szemlencse is képes regenerálódni a pigmentált epitél sejtek transzdifferenciációja révén (Day – Beck, 2011). Az ilyen típusú genetikai újraprogramozás egyik speciális formája a transzdetermináció. Az ecetmuslica (Drosophila melanogaster) lárvák testében – a többi teljes átalakulással fejlődő rovarhoz hasonlóan – kisméretű, diploid sejtekből álló fészkek, ún. imaginális korongok találhatók, amelyek a majdani kifejlett állat (imágó) különböző szerveinek (lábak, szárnyak, szemek, antennák, ivarszervek stb.) a kezdeményei. Ezeknek az imaginális korongoknak a sorsa genetikailag szigorúan meghatározott (determinált), az egyes lábaknak megfelelő korongokból például csak az adott láb, az antennakorongokból csak a megfelelő antenna alakulhat ki. Így ha egy lábkorongot eltávolítunk az eredeti helyéről és a lárva fejébe ültetjük át, a metamorfózis után olyan légy bújik ki a bábból, amelynek egyik lába a fején van. A láb imaginális korong tehát a transzplantáció után az új környezetben is megőrzi az identitását (determináltságát). Egészen más eredményt kapunk, ha a lábkorongot először feldaraboljuk, a darabokat egy-egy kifejlett ecetmuslica testüregébe ültetjük, egy ideig hagyjuk őket növekedni (regenerálódni), és csak ezután végezzük el a transzplantációt. Ilyenkor a lábkorongból származó fragmentumok egy része elveszíti determináltságát, és a transzplantáció után például szárnnyá – vagy más szervvé – fejlődik (Maves – Schubiger, 1999).

Így vetődött fel, hogy intenzív regeneráció során talán az emlősök szöveti őssejtjei is képesek lehetnek transzdifferenciációra. Az 1990-es évek végén, a 2000-es évek elején a vezető tudományos folyóiratok – Nature, Science, Cell – hasábjain sorra jelentek meg azok a szenzációs közlemények, amelyek szerint például a vérképző őssejtekből – a vérsejteken kívül – neuronok és gliasejtek, váz- és szívizomrostok (Gussoni et al., 1999), valamint hepatociták (Lagasse et al., 2000) is keletkezhetnek. Ha infarktuson átesett egerek szívébe autológ csontvelőt oltanak, az állatok elhalt szívizomrostjainak 60–70%-a kilenc nap alatt regenerálódik (Orlic et al., 2001). A csontvelőtranszplantált betegek májsejtjeinek 1–2%-a általában donor eredetű (Alison et al., 2000). Úgy tűnt tehát, hogy a regenerációs folyamat(ok) során valóban megváltozott a szöveti őssejtek elkötelezettsége, akár a csíravonalhatárokat is képesek voltak átlépni, amikor például a mezodermális eredetű vérképző őssejtekből ektodermális eredetű – ideg- és glia- – sejtek keletkeztek (2. ábra). Sajnos később más munkacsoportoknak csak részben sikerült ezeket, a regeneratív orvoslás szempontjából igen fontosnak tűnő eredményeket megerősíteni, és a szöveti őssejtek in vivo transzdifferenciációja kérdésessé vált (Wagers – Weissman, 2004). Kiderült, hogy a donor eredetű vérképző őssejtek beépülése a recipiens állatok, illetve betegek különböző – nem vérképző – szöveteibe minimális (általában jóval 1% alatti). Ez az érték pedig a beültetett sejtek azonosítására szolgáló módszereink hibahatárának közelében, sőt sokszor azon belül van. Ráadásul az egyértelműen pozitívnak tűnő eredmények is általában csak a szövetekbe vándorolt vérképző eredetű sejtek (például: makrofágok) jelenlétére (Massengale et al., 2005), netán a transzplantált őssejtek és a recipiens egyes testi sejtjeinek (például: májsejtek) fúziójára utalnak (Vassilopoulos et al., 2003). Mindezek alapján ma úgy véljük, hogy ha képesek is in vivo transzdifferenciálódni egyes – megváltozott mikrokörnyezetbe került és gyorsan osztódó (regenerálódó) – őssejtek, a jelenség az emlősökben rendkívül ritka, az átültetett sejteknek csak egy töredékét érinti (Theise, 2010)

Indukált transzdifferenciáció in vitro

In vitro kultúrában számos véglegesen differenciálódott testi sejt, illetve szöveti őssejt késztethető transzdifferenciációra. Néhány esetben a kívánt irányú genetikai újraprogramozás különböző kis molekulák és fehérjék (növekedési faktorok, morfogének) alkalmazásával is kiváltható, vagy legalábbis elősegítő. Ha például leukémiagátló-faktor (LIF) tartalmú tápfolyadékban növesztett májsejtekhez – a LIF megvonása után – magas koncentrációban glükózt adunk, a hepatociták glukagon- és inzulintermelő sejtekké differenciálódnak (Yang et al., 2002). A másik lehetőség, hogy a kétféle sejtet közös tenyészetben tartjuk. A szívizom jelenlétében növesztett mesenchymalis őssejtek egy része például kardiomiocitákká differenciálódik (Yoon et al., 2005), vagyis egy testi sejt – részben közvetlen sejt–sejt kölcsönhatások, részben az általa termelt szolubilis faktorok és extracelluláris mátrixmolekulák révén – képes befolyásolni egy másik, szöveti őssejt differenciálódásának irányát. De úgy is előállíthatunk kardiomiocitákat mesenchymalis őssejtekből, hogy az őssejteket szívizom extraktummal kezeljük (Gaustad et al., 2004). Ezek a módszerek azonban általában rossz hatásfokkal működnek és – ami nagyobb probléma – a keletkező sejtek újraprogramozása sem tökéletes (Perán et al., 2011).

Valódi transzdifferenciációt inkább csak a megfelelő, a kívánt sejtfejlődési sor differenciálódása során kulcsszerepet játszó, úgynevezett „mester” transzkripciós faktor(ok)nak (TF) a sejtekbe juttatásával lehet elérni. Néhány ilyen példát mutatunk be a 3. ábrán. Elsőként Robert L. Davis és munkatársai (1987) állítottak elő fibroblasztokból mioblasztokat úgy, hogy az előbbi sejtekbe bejuttatták az izomfejlődés egyik legfontosabb, a MyoD transzkripciós faktort kódoló szabályozó génjét. Hasonlóan lehet B-limfocitákból a C/EBPa TF segítségével macrofágokat előállítani (Di Tullio et al., 2011). Ugyanakkor fibroblasztokat macrofágokká már csak két – C/EBPa és PU.1 (Laiosa et al., 2006) – fibroblasztokat idegsejtekké pedig három – Ascl1, Brn2 és Myt1l (Vierbuchen et al., 2010) – TF egyidejű alkalmazásával lehet alakítani. Minél távolabb van tehát egymástól a kiindulási és az előállítani kívánt sejttípus, annál több „mester” TF egyidejű kifejeződésére van szükség ahhoz, hogy a transzdifferenciáció végbemenjen. Az érintett TF-ok valószínűleg ugyanazok, amelyek az egyedfejlődés során is biztosítják a különböző sejtfejlődési sorok elköteleződését.

A „mester” TF-okat kódoló géneket természetesen nem csak bevinni lehet a sejtekbe, elnémításuk (génkiütéses – knock out technika) sokszor szintén rendkívül hatékony módszer a sejtek sorsának befolyásolására. A Pax5 gén például a B-limfocita fejlődési sor mesterregulátora. Az általa kódolt Pax5 transzkripciós faktor hiányában (Pax5 -/- knock out egerekben) a B- limfociták fejlődése a korai (pre-BI sejt) stádiumban megáll. Az immunglobulin nehézlánc génátrendeződés a folyamat első lépése, egy diverzitás és egy joining szekvencia összekapcsolódása (DHJH joining) után elakad. Azt várnánk, hogy az ilyen Pax5 -/- pre-B sejtek életképtelenek. Ezzel szemben csontvelői sztrómasejtekre ültetve, nagy mennyiségű IL-7 jelenlétében, önfenntartó osztódásba kezdenek in vitro kultúrában. Ha az IL-7-et fokozatosan különböző más citokinekkel helyettesítik a tenyészetekben, a Pax5 hiányos pre-BI sejtekből granulociták, dendritikus sejtek és macrofágok keletkeznek. Sőt, tímuszkultúrában vagy működő tímusz-szal rendelkező állatba oltva T-limfocitákká is differenciálódhatnak (4. ábra). A normális B-sejt fejlődése során tehát a Pax5 fehérje kettős szerepet játszik. Egyrészt elősegíti a B-sejt-specifikus gének expresszióját, másrészt gátolja a többi limfo-hematopoetikus sejtfejlődési sor „mester-regulátor” génjeinek kifejeződését a pre-B-sejtekben (Nutt et al., 1999). Utóbbi nem a Pax5 TF egyedi sajátsága, hanem általánosan jellemző a „mester” TF-okat kódoló gének működésére. A szöveti ős- és elődsejtek éppen azért képesek még többféle genetikai program megvalósítására, mert egyidejűleg számos „mester” TF-t fejeznek ki (azaz multipotensek, lásd még a Bevezetőben). Amikor valamelyik „mester” TF szintje elér egy kritikus értéket a sejtben, és az valamelyik fejlődési sor (például: A) irányába elkötelezetté válik, akkor a másik (B) fejlődési irány (vagy irányok) TF-ait kódoló gének kifejeződése gátlás alá kerül. Ennek a keresztgátlásnak – aminek pontos mechanizmusát ma sem ismerjük – az egyik legismertebb példája a vérképző őssejtek eritrocita-megakariocita, illetve granulocita-monocita irányú differenciálódásának szabályozása (5. ábra). Az őssejtben mind a Gata1, mind a PU.1 gének kifejeződnek. Ha a Gata1 TF-szintje emelkedik a sejtben, akkor a PU.1 gén kifejeződése csökken, és a sejt hamarosan csak eritrocita-megakariocita irányba képes differenciálódni. Fordított esetben a Gata1 gén működése szűnik meg, és a sejt a granulocita-monocita fejlődési irányba köteleződik el (Eguizabal et al., 2013).

Végül: a legújabb transzdifferenciációs módszer a „Jamanaka-faktorok” felhasználásán alapul. A sejtekbe – például fibroblasztokba – bejuttatják az indukált pluripotens sejtek előállításánál alkalmazott négy gént (Oct4, Sox2, Klf4, és c-Myc), de nem várják meg a pluripotens sejtek kialakulását, hanem néhány nap múlva egy morfogént (csont morfogenetikus fehéje-4-et) adnak a tápfolyadékhoz. Ilyenkor a fibroblasztok idegsejtekké transzdifferenciálódnak (Efe et al., 2011).

Néhány záró gondolat

A transzdifferenciáció, vagy, ahogy újabban gyakran nevezik: fejlődési sorváltás (lineage conversion) tehát létező jelenség. Az egyedfejlődés és a szövetregeneráció során in vivo is megfigyelhető, in vitro pedig viszonylag egyszerűen kiváltható a „mester” TF-okat kódoló gének manipulációjával. Ma már szinte hetente jelennek meg a különböző szöveti őssejtek és véglegesen differenciálódott testi sejtek sikeres újraprogramozásáról szóló beszámolók. Ez reményt adhat olyan betegségek kezelésére is, amelyek rosszul vagy egyáltalán nem osztódó testi sejtek (idegsejtek, inzulintermelő béta-sejtek, porcsejtek) pusztulására vezethetők vissza. A módszer nagy előnye lenne, hogy a pusztuló sejteket a beteg saját sejtjeivel lehetne pótolni, így a beavatkozás után nem kellene immunológiai komplikációkkal számolni. Megjósolni természetesen nem tudjuk, hozhat-e áttörést a sejtek genetikai újraprogramozása az orvostudományban, és ha igen, akkor ez mikor következik be. Annyit azonban biztosan állíthatunk, hogy a transzdifferenciáció kutatása már eddig is alapvetően megváltoztatta az egyedfejlődés, differenciálódás és szövetregeneráció génszintű szabályozásáról alkotott képüket.

IRODALOM

Alison, M. R. – Poulsom, R. – Jeffery, R. – Dhillon, A. P. – Quaglia, A. – Jacob, J. – Novelli, M. – Prentice, G. – Williamson, J. – Wright, N. A. (2000): Hepatocytes from Non-Hepatic Adult Stem Cells. Nature. 406, 257.

Davis, R. L. – Weintraub, H. – Lassar, A. B. (1987): Expression of a Single Transfected cDNA Converts Fibroblasts to Myoblasts. Cell. 51, 987–1000.

Day, R. C. – Beck, C. W. (2011): Transdifferentiation from Cornea to Lens in Xenopus laevis Depends on BMP Signalling and Involves Upregulation of Wnt Signalling. BMC Developmental Biology. 11, 54.

Di Tullio, A. – Vu Manh, T. P. – Schubert, A. – Castellano, G. – Månsson, R. – Graf, T. (2011): CCAAT/Enhancer Binding Protein Alpha (C/EBP(Alpha))-Induced Transdifferentiation of Pre-B Cells into Macrophages Involves No Overt Retrodifferentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 108, 17016–17021.

Efe, J. A. – Hilcove, S. – Kim, J. – Zhou, H. – Ouyang, K. – Wang, G. – Chen, J. – Ding, S. (2011): Conversion of Mouse Fibroblasts into Cardiomyocytes Using a Direct Reprogramming Strategy. Nature Cell Biology. 13, 215–222.

Eguizabal, C. – Montserrat, N. – Veiga, A. – Izpisua Belmonte, J. C. (2013): Dedifferentiation, Transdifferentiation, and Reprogramming: Future Directions in Regenerative Medicine. Seminars in Reproductive Medicine. 31, 82–94.

Gaustad, K. G. – Boquest, A. C. – Anderson, B. E. – Gerdes, A. M. – Collas, P. (2004): Differentiation of Human Adipose Tissue Stem Cells Using Extracts of Rat Cardiomyocytes. Biochemical and Biophysical Research Communications.; 314, 420–427.

Gussoni, E. – Soneoka, Y. – Strickland, C. D. – Buzney, E. A. – Khan, M. K. – Flint, A. F. – Kunkel, L. M. – Mulligan, R. C. (1999): Dystrophin Expression in the Mdx Mouse Restored by Stem Cell Transplantation. Nature. 401, 390–394.

Halley, Julianne D. – Winkler, D. A. – Burden, F. R. (2008): Toward a Rosetta Stone for the Stem Cell Genome: Stochastic Gene Expression, Network Architecture, and External Influences. Stem Cell Research. 1, 157–168.

Lagasse, E. – Connors, H. – Al-Dhalimy, M. – Reitsma, M. – Dohse, M. – Osborne, L. – Wang, X. – Finegold, M. – Weissman, I. L. – Grompe, M. (2000): Purified Hematopoietic Stem Cells Can Differentiate into Hepatocytes in vivo. Nature Medicine. 6, 1229–1234.

Laiosa, C. V. – Stadtfeld, M. – Xie, H. – De Andres-Aguayo, L. – Graf, T. (2006): Reprogramming of Committed T Cell Progenitors to Macrophages and Dendritic Cells by C/EBP Alpha and PU. 1 Transcription Factors. Immunity. 25, 731–744.

Massengale, M. – Wagers, A. J. – Vogel, H. – Weissman, I. L. (2005): Hematopoietic Cells Maintain Hematopoietic Fates upon Entering the Brain. The Journal of Experimental Medicine. 201, 1579–1589.

Maves, L. – Schubiger, G. (1999): Cell Determination and Transdetermination in Drosophila Imaginal Discs. Current Topics in Developmental Biology. 43, 115–151.

Nutt, S. L. – Heavey, B. – Rolink, A. G. – Busslinger, M. (1999): Commitment to the B-Lymphoid Lineage Depends on the Transcription Factor Pax5. Nature. 401, 556–562.

Orlic, D. – Kajstura, J. – Chimenti S. – Jakoniuk, I. – Anderson, S. M. – Li, B. – Pickel, J. – Mckay, R. – Nadal-Ginard, B. – Bodine, D. M. – Leri, A. – Anversa, P. (2001): Bone Marrow Cells Regenerate Infarcted Myocardium. Nature. 410, 701–705.

Park, K. S. – Wells, J. M. – Zorn, A. M. – Wert, S. E. – Laubach, V. E. – Fernandez, L. G. – Whitsett, J. A. (2006): Transdifferentiation of Ciliated Cells During Repair of the Respiratory Epithelium. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34, 151–157.

Patapoutian, A. – Wold, B. J. – Wagner, R. A. (1995): Evidence for Developmentally Programmed Transdifferentiation in Mouse Esophageal Muscle. Science. 270, 1818–1821.

Perán, M. – Marchal, J. A. – Rodríguez-Serrano, F. – Alvarez, P. – Aránega, A. (2011): Transdifferentiation: Why and How? Cell Biology International. 35, 373–379.

Takahashi, K. (2012): Cellular Reprogramming—Lowering Gravity on Waddington’s Epigenetic Landscape. Journal of Cell Science. 125, 2553–2560.

Theise N. D. (2010): Stem Cell Plasticity: Recapping the Decade, Mapping the Future. Experimantal Hematology. 38, 529–539.

Vassilopoulos, G. – Wang, P. R. – Russell, D. W. (2003): Transplanted Bone Marrow Regenerates Liver by Cell Fusion. Nature. 422, 901–904.

Vierbuchen, T. – Ostermeier, A. – Pang, Z. P. – Kokubu, Y. – Südhof, T. C. – Wernig, M. (2010): Direct Conversion of Fibroblasts to Functional Neurons by Defined Factors. Nature. 463, 1035–1041.

Waddington, Conrad Hal (1957): The Strategy of the Genes. Allen & Unwin, London

Wagers, A. J. – Weissman, I. L. (2004): Plasticity of Adult Stem Cells. Cell. 116, 639–648.

Yang, L. – Li, S. – Hatch, H. – Ahrens, K. – Cornelius, J. G. – Petersen, B. E. – Peck, A. B. (2002): In Vitro Trans-differentiation of Adult Hepatic Stem Cells into Pancreatic Endocrine Hormone-producing Cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 99, 8078–8083.

Yoon, J. – Shim, W. J. – Ro, Y. M. – Lim, D. S. (2005): Transdifferentiation of Mesenchymal Stem Cells into Cardiomyocytes by Direct Cell-to-Cell Contact with Neonatal Cardiomyocyte But Not Adult Cardiomyocytes. Annals of Hematology. 84, 715–721.

Forrás: Magyar Tudomány –  A Magyar Tudományos Akadémia folyóirata, 2013. június